合成FAQ

2013年10月26日

1. 进行PAGE 电泳时,长度完全一样的 Oligo DNA 为什么泳带不在同一位置?

                 
  • A G C T 的组份不同,电泳速度不同;
  • DNA 的立体结构不同,电泳速度不同;

这种情况在 Oligo DNA 越短时越容易发生,长链 Oligo DNA 之间差别较小。

 

2. 琼脂糖电泳后进行EB染色发现条带很弱,是Oligo DNA的量不够么?

                 

EB是通过嵌合到核酸的双螺旋结构中而使其显色的,而合成DNA是单链的,只有通过形成局部发夹结构或其它双螺旋结构的时候才能被染色。不同的引物由于碱基组成不同,形成二级结构的可能性不同,EB的染色程度也会有差异。比如Oligo(dT)等不形成二级结构,EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量,而用紫外分光光度计检测,或用上面说的PAGE凝胶电泳用荧光TLC板在紫外灯下观察,也可以用银染的方法。

3. 使用3%的Agarose凝胶电泳合成的 Oligo DNA 制品,为什么有很多条带?

                 

由于Oligo DNA 是单链 DNA ,容易形成复杂的立体结构,因此进行 Agarose 电泳时,容易出现多条泳带(更不能用 Agarose 电泳来进行定量了)。Oligo DNA 的电泳一定要使用变性 PAGE 电泳,Agarose电泳对于小单链的DNA引物的区分度不够。而且,用荧光TLC板在紫外灯下观察,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。如果条件许可,也可以用银染方式染色。

4. 如何检测Oligo DNA的纯度?

                 

实验室检测时比较方便的作法是进行PAGE凝胶电泳。一般用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳即可,小于12bp的短链使用20% 的凝胶,大于60bp的引物使用12% 的凝胶。取0.2-0.5OD的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95,2mins)600V电压进行电泳,一定时间后(2-3小时)剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下观察,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。如果条件许可,也可以用银染方式染色。

5. 如何测定引物的OD值:

                 

DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比,因此使用紫外分光光度计定量是最科学的,测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。进行OD值测定时,分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。

例如:您拿到一管引物DNA干粉,用1ml水溶解成母液。取该母液50μL稀释成1ml,在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25,说明该50μL中含有0.25ODDNA,也即说明原来1ml母液中含有5ODDNA

6. 需要合成多少OD的oligo?

                 

一般来说,20BP 2 OD引物可以做400-50050ul标准PCR反应,以及2000-2500次的测序反应。因此,2 OD DNA 量足以进行一般的实验工作。如果是做基因拼接或退火后做连接,1 OD就足够了,无论是 PAGE 纯化,还是 HPLC 纯化,增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。所以,为了保证制品质量,我们一般把每次的纯化量控制在2OD 左右。

7. PCR 产物经克隆后测序发现引物处的碱基有错误,为什么?怎么办?                 

三博远志总结出了以下一些原因,仅供参考:

 

  • PCR 过程的错配;
  • 克隆过程的突变;
  • 化学合成过程中,未知的错误;应该说,上述这些情况发生的可能性都极低。然而,合成的 DNA 链越长,发生这种情况的机率也就越大。
  • 概率问题,因为引物纯度不可能是 100% ,样品的纯度也不是100%,因此挑选克隆时,有可能挑选了杂质引物扩增出的 PCR 产物做了克隆。

 

因此,请重新挑选克隆测序,也许结果会变好。根据我们的经验,40个碱基以下的引物,测1-2个克隆就可以了;40个以上的特别是用于全片段拼接合成的,就需要多测一些了。一般情况下,每个克隆突变的位点都不一样,提示正确的总是有的,就是如何找到它。

 

如果挑选 2 -3 个克隆测序情况还没改观,我们会免费重新合成引物。不过重合的引物和第一次的引物一样,还有可能错误。如果还不行可以考虑重设引物,提高样品的纯度上下功夫。总之,实验有时候就是这么不顺利,不要怨天忧人,运气不好生气也没用,还不如心平气和呢?

8. 三博公司的 Oligo DNA 制品包装中为什么不提供电泳照片?                 

做过 Oligo DNA PAGE 电泳的人员都知道,用EtBr 等染色剂染色时,同一 OD 量的不同序列的 DNA 制品电泳时的泳带亮度(清晰度)是不一样的。原因在于 EtBr 等染色剂的染色是渗透至 DNA 的双链之间的,而合成的 Oligo DNA 是单链, Oligo DNA 自身形成的立体结构越复杂,EtBr 的染色就越容易, DNA 带也就越亮。相反,有一些 Oligo DNA 由于不形成立体结构,根本就不为 EtBr 所染色。因此,我们认为有些公司对所有产品都提供黑地亮带,而且差不多一样亮的电泳照片是不符合事实的。三博公司的每一条引物在出货之前都要进行严格的电泳检测,拿出1/10 OD的引物来鉴定,在荧光玻璃下面看到白地黑色条带,带形一致没有杂带,有杂带的引物是绝不会发货的,而在荧光玻璃上面照像比较困难,且不美观,所以不好给顾客提供像片。但请您放心三博的质量是您值得信赖的。

9. Oligo DNA溶解后发现有少许沉淀,会影响实验结果吗?                 

Oligo DNA制品PAGE纯化后要使用C18柱进行吸附,偶而会有微量的树脂溢出而进入制品。树脂不影响任何反应结果,请稍许离心后取上清使用即可。

10. Oligo DNA定量不准是怎么回事儿?                 

我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告,出现这种情况的可能性有:(1)生产人员定量错误。这种可能性有,但是不大,因为我们的生产人员都是经过严格的培训,程序化规范操作和换算。公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户OD数。(2)引物抽干或收样过程中,引物干粉可能意外丢失。这种情况很少见。(3)系统误差,我们认为10%左右为允许误差。使用过程中,引物工作浓度范围很宽,定量上的少许偏差不影响实验。(4)用户没有能够正确理解引物OD数的含义,没有能够正确使用分光光度计,特别是使用微量测定;或者用户没有将OD读数,正确地转换成母液中的OD数。这种情况比较常见。(5)用户收到引物干粉时,打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。

11. 测定了Oligo DNA的OD值后发现A260/A280<1.8,制品质量(纯度)合格吗?                 

有的老师问:引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低,怎么会有蛋白质污染?其实引物化学合成,是没有机会蛋白质污染的。Oligo DNA和一般提取的双链DNA不同,A260/A280的比值不能准确衡量Oligo DNA制品的质量,该比值依赖于序列中的各种碱基的组份,比值过低一般是由于引物中C/T 的含量较高所致。下面是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。

 

 Base

Composition   A260/280

5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3

2.50

5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3

1.85

5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3

1.15

5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3

1.14

5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3

1.66

12. 合成的引物PCR后无目的条带是什么原因                 

PCR 反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑。

 

  • 引物和模板是否匹配;
  • 引物本身是否有立体结构,或者二条引物之间是否形成高级结构;
  • PCR 反应用试剂是否正常;
  • PCR 仪是否工作正常;
  • PCR 反应条件是否合适;
  • 引物设计是否有问题;

 

如果一切正常,还无法解决问题时,可能是引物合成的问题,我们可以免费重新合成引物,再次合成还不成功就有可能不是引物的问题啦(合成两次都不成功的要收一次费用)。

13. Oligo DNA片段退火后不能连接到载体上是什么原因?                 

连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上,引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果,需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构,退火的难度较大,退火时需要提高退火温度。

14. 一般的合成 Oligo DNA 的 5‘ 和 3‘ 末端有磷酸基团吗?                 

没有磷酸基团, 5‘ 3‘ 末端均为 - OH 基。如需要加磷酸基团,订货时请特别注明,此时需收取磷酸化的费用。

15. Oligo DNA 最长可以合成多少个碱基?                 

引物越长,出现问题的概率就越大。以每步反应效率为 99% 进行计算,粗略计算合成到 100 个碱基时,目的 DNA 片段的比例便为但有些厂家曾报道合成了 150mer Oligo DNA片段。三博公司也曾合成过120mer左右的Oligo DNA 制品。但根据我们的经验,要想保证合成DNA 的碱基 90% 正确,Oligo DNA的长度最好不要超过70mer80mer以上要想保证一个碱基都不错就非常危险了,须十分注意。

16. 如何提高引物的纯度?怎样才能保证 Oligo DNA 的正确性?                 

  • 合成 Oligo DNA 时,选用高纯度级制品;
  • 避免使用大于50mer 的长链 Oligo DNA ,最好选用小于 35mer 的合成 DNA 制品。不要超过2OD60个碱基以上最好不超1OD,国内有一个不好的现象,长链引物要的量都比较大,导致割的条带比较宽,建议您减少OD数,引物遇到的问题可能就会少一些;
  • 进行克隆实验时,每次克隆都须进行测序验证,以保证序列的正确性,然后再进行进一步实验,进行蛋白表达实验时,尤其需要注意。  
  • 表达实验之前一定要对 DNA 序列进行验证,这是实验的常识;
  • 我们可以免费重新合成引物;
  • 如进行索赔时,按国际行业惯例,索赔范围限于制品价格范围之内。 

17. 进行蛋白表达实验数个月不成功,后经测序发现引物处有错误,怎么办?                 

 

18. 如果测序发现引物突变,是否有补偿?                 

我们可以免费重合一次引物,没有其他补偿或赔偿,不能承担其他连带责任,这是国际行规。原因我们在前面已提到,化学合成准确率(或纯度)不可能达到100%,客户样品的纯度关系也很大,我们总结使用引物错误的概率有1%左右,关于这方面的信息在每个产品说明书里都有事先说明。

19. TaqMan 探针设计时应遵循哪些原则?                 

  • 探针应位于两引物之间;
  • 探针中碱基GC的含量应在20%80%之间;
  • 避免同种碱基成串出现,特别是碱基“G”;
  • 碱基G不要出现在5′末端;
  • 探针的Tm值要比引物的Tm值高8-10℃,应在68-70℃之间;
  • 探针长度超过30个碱基时,最好把淬灭基团放在中间,以防止荧光本底过高,这时探针的3′末端应加磷酸基封阻,以防探针延伸。

20. 淬灭基团为TAMRA或ECLIPSE的双标记荧光探针在使用上有什么不同?                 

由淬灭基团TAMRAECLIPSE组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针(Hydrolysis Probes),或称“TaqMan”探针,用于Real-time PCR实验。由于TAMRAECLIPSE光谱学性质不同(见下图),作为淬灭基团使用时的特点也不同,现说明如下:

 

加图12

 

  • TAMRA为荧光染料,在淬灭报告基团的同时,自身会在更高波长处发射荧光,此发荧光会对报告基团的检测造成影响,探针荧光本底相对较高。而ECLIPSE为非荧光染料,淬灭报告基团,但自身不发射荧光,因此,探针荧光本底低,信噪比更大,检测灵敏度更高。
  • 淬灭基团对报告基团的淬灭有赖于二者的光谱交盖(Overlapping),也即报告基团的荧光波长应落在淬灭基团的吸收光谱波长范围内。对比TAMRAECLIPSE的吸收光谱可见,TAMRA的吸收光谱波长范围窄,与之可匹配的报告基团种类比较少,而ECLIPSE具有更宽的吸收波长范围(390nm-625nm),可淬灭的报告基团种类很多(FAMHEXTAMRAROX等均可),用于多重PCR Multiplexing PCR)时可有多种选择,因此淬灭基团为ECLIPSE的双标记荧光探针更适合于多重PCR

21. FITC、6-FAM、5-FAM标记之间有何区别?                 

他们都是荧光素标记(Fluorescein),三者结构间的区别如下:

 

从结构图可见,5-FAM6-FAM互为异构体:而FITC则在与oligo的连接方式上(硫脲键)有别于前者(酰胺键),但它们的发色团均为荧光素,通常使用中没有区别。

 

 

22. Biotin标记有三种,它们之间有何不同?                 

 SS-Biotin可提供比较长的连接臂(臂长约24.3A),有利于BiotinAvidin间的结合,而且分子中含有S-S键,可使用还原剂(50 mM DTT100 mM巯基乙醇)方便地将探针分子(不再带有Biotin基团)与靶序列分开。Imino-Biotin可提供较短的连接臂(约13.5A),其最大特点是BiotinAvidin的分离可在较温和的条件下进行:8M盐酸胍(pH4.0)。普通的Biotin提供与ss-Biotin相似长度的连接臂,但只能用8M盐酸胍(pH1.5)分离BiotinAvidin.

23. 进行反义 DNA (Antisense DNA) 实验时,是否要对 DNA 链全部进行 S 化修饰?                 

DNA S 化修饰后比较稳定,在细胞中不会被核酸酶等分解。如果整条链全部修饰成 S DNA ,的确能增加 DNA 的稳定性,但此时会降低 DNA 和目的模板结合的效率。

 

因此,现在一般的科研人员通常采用将 DNA 片段两端的数个碱基进行 S 化修饰,这样既能取得保护 DNA 的效果,又能增加 Antisense DNA 和目的模板的结合能力。

 

即使如此,现在还是有很多科研人员采用了全部 S 化的修饰方法,并且能得到非常良好的实验结果。因此,任何一项科研工作都不是绝对的,应根据具体情况设计实验方案。

 

 

24. 如何将两条互补的单链退火形成双链?                 

用退火缓冲液(10 mM Tris pH=8.050 mM NaCl, 1 mM EDTA)溶解引物,浓度:15 OD/100μl。将二条链等摩尔混合。94℃保温5分钟后,冷却至室温,4℃保存供实验使用。

25. 平端的 PCR 产物难以克隆,为什么?                 

由于一般的 PCR 用引物的 5‘ 末端都没有 P ,因此,扩增后的 PCR 产物的 5‘ 末端也没有 P 。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时,无法克隆进去;而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时,背景会极高。此时请对 PCR 产物的 5‘ 端进行磷酸 (P) 化处理。  

 

来源:长沙凯诺生物科技有限公司

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